Ремоделювання сполучної тканини під дією вуглекислотного лазера для шліфування фотопошкодженої шкіри

Мета: кількісно вивчити динаміку молекулярних змін, залучених в ремоделювання дерми після лазерної шліфовки фотоповрежденной шкіри людини за допомогою діоксиду вуглецю (CO2). Дизайн: послідовні біохімічні аналізи in vivo після лазерної терапії. Суб'єкти: Добровольча вибірка з 28 дорослих у віці від 48 до 76 років з клінічно очевидними фотопошкодженнями передпліч.

Втручання: Фокусна шліфування CO2-лазером фотопошкоджених передпліч і серійні біопсії на початковому рівні і в різний час після лікування.

Основні показники результатів. Для оцінки рівнів проколагенів типу I і типу III використовувалися технології полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу зі зворотною транскриптазою і імуногістохімія; матриксні металопротеїнази (ММП) 1, 3, 9 і 13; тропоеластин; фібрилін; первинні цитокіни інтерлейкін 1β і фактор некрозу пухлини α; і профібротичний цитокін, трансформуючий фактор росту β1.

Результат. Продукція проколагену типу I і матрична РНК проколагену типу III досягла піку в 7,5 і 8,9 разів вище вихідного рівня, відповідно, через 21 день після лікування і залишалася підвищеною протягом як мінімум 6 місяців. Підвищення рівня інформаційної РНК декількох цитокінів (інтерлейкіну 1β, фактора некрозу пухлини α і трансформуючого фактора росту β1) передувало і / або супроводжувало зміни рівнів колагену. Було відзначено помітне збільшення рівнів матричної РНК ММП-1 (39 130 разів), ММП-3 (1041 разів), ММП-9 (75 разів) і ММП-13 (767 разів). Рівні фібриліну і тропоеластину підвищувалися з затримкою через кілька тижнів після лікування.

Висновки: біохімічні зміни, що спостерігаються після шліфування за допомогою CO2-лазера, відбуваються в результаті добре організованої і добре відтворюваної реакції загоєння ран, що призводить до помітних змін в структурі дерми. Ці кількісні зміни можуть служити засобом для порівняння, оскільки оцінюються інші терапевтичні методи, призначені для поліпшення зовнішнього вигляду фотопошкодженої шкіри.

Лазерне шліфування на вуглекислому газі (CO2) залишається одним з найбільш ефективних методів омолодження обличчя. Хоча кілька механізмів можуть бути задіяні у створенні косметичних поліпшень, що спостерігаються після абляційної лазерної шліфовки, збільшення вироблення колагену, здається, є одним з найбільш значущих. Незважаючи на ряд гістологічних та ультраструктурних досліджень ефектів терапії CO2-лазером, відносно мало відомо про результуючі кількісні зміни вироблення колагену і часу, протягом якого ці події відбуваються. Таким чином, ми прагнули кількісно вивчити зміни в рівнях колагену після обробки CO2-лазером фотопошкодженої шкіри людини in vivo разом зі змінами декількох ключових генів, які, як відомо, беруть участь у ремоделюванні дерми.

Ми припустили, що загоєння після шліфування за допомогою CO2-лазера буде відповідати фундаментальним механізмам загоєння ран. Однак ми вважали, що результуючі кількісні зміни у виробленні колагену можуть бути значно більше, ніж спостережувані після поранення, пов'язані з іншими причинами, таким чином, принаймні, частково пояснюючи значні клінічні поліпшення, пов'язані з цим методом лікування. Незважаючи на недавню появу безлічі неабляційних лазерів та інших пристроїв, спрямованих на поліпшення зморшок, пов'язаних з фотостарінням, абляційна лазерна шліфовка залишається золотим стандартом в цій області з точки зору ефективності. Таким чином, додаткова мета цього проекту полягає в тому, щоб забезпечити кількісну картину біохімічних змін, пов'язаних з терапією лазером CO2, з якою можна в кінцевому підсумку порівняти ефекти інших нових неабляційних методів лікування. Хоча біохімічні зміни не завжди призводять безпосередньо до клінічних змін, така порівняльна інформація може в кінцевому підсумку надати лікарям і пацієнтам інформацію, корисну для прийняття терапевтичних рішень.

Методи і матеріали

Це дослідження було схвалено інституційною наглядовою радою Медичної школи Мічиганського університету в Анн-Арбор, і від усіх учасників дослідження було отримано письмову інформовану згоду. Було набрано 28 осіб у віці від 48 до 76 років з клінічно очевидними фотопошкодженнями передпліч. Кожному суб'єкту в фокальну область одного передпліччя вводили 1% лідокаїну з адреналіном для досягнення анестезії, а потім обробляли CO2-лазером протягом 2 проходів при 300 мДж і 60 Вт і з настройками комп'ютерного генератора шаблонів 3/5/6. Перфоровані біопсії (3 мм) отримували з обробленої області на початковому рівні і до 5 додаткових тимчасових точок після лікування. Між кожною ділянкою біопсії залишалося не менше 5 мм обробленої лазером шкіри, не взятої для біопсії. В результаті лікування повністю видалений міжфоллікулярний епідерміс. Тотальну РНК екстрагували із зразків шкіри на всю товщину, а рівні матричної РНК (мРНК) конкретних генів кількісно визначали за допомогою технології полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою в реальному часі. Зразки тканин аналізували на рівні матриксних металопротеїназ (ММП) 1, 3, 9 і 13; проколаген типу I і типу III; інтерлейкін 1β (ІЛ-1β); фактор некрозу пухлини α (TNF-α); трансформуючий фактор росту β1 (TGF-β1); тропоеластин; і фібрилін. Певні білки були локалізовані імуногістохімічним методом з використанням заморожених зрізів. Зрізи (7 мкм) фарбували на MMP-1 моноклональним антитілом MAB 1346, MMP-3 з моноклональним антитілом MAB 13412, MMP-9 з моноклональним антитілом MAB 13415 (всі антитіла MMP були отримані від Chemicon International Inc, Темекула, Каліфорнія), і проколаген I типу (SP1.D8, розроблений доктором медицини Хайнцем Фуртмайром і отриманий з банку гібридних досліджень розвитку, розроблений під егідою Національного інституту дитячого здоров'я і людського розвитку і підтримуваний Департаментом біологічних наук Університету Айови). Наявність первинного антитіла, пов'язаного з тканиною, візуалізували за допомогою комплексу Вторинне антитіло-пероксидаза.

Зразки біопсії були отримані від 4 суб'єктів на початку і через 6 місяців після лікування. Ці суб'єкти брали участь у дослідженні, яке включало щоденне нанесення зволожуючого крему протягом 3 тижнів перед лікуванням лазером CO2. Всі інші аспекти дослідження цих суб'єктів були аналогічні описаним раніше. Для біохімічного аналізу зразків шкіри, отриманих через 6 місяців після обробки, і відповідної попередньої обробки контрольна шкіра, епідерміс і дерма були розділені за допомогою лазерної мікроскопії (Leica LMD Laser Microdissection System; Leica Microsystems Inc, Bannockburn, Ill). Рівні мРНК проколагену і ММР в епідермісі і дермі визначали кількісно, як описано раніше.

Зміни в біохімічних кінцевих точках в ході дослідження статистично оцінювали за допомогою дисперсійного аналізу з повторними вимірами. Індивідуальні попарні порівняння значень в кожний наступний момент часу з вихідними рівнями проводилися за допомогою тесту Даннета. Частота помилок типу I була встановлена на рівні 0,05. При необхідності перед аналізом виконувалися логарифмічні перетворення даних для досягнення нормальності, і при необхідності дані відображалися на фігурах з осями ординат з логарифмічним масштабуванням. Зведена статистика включає середні і стандартні помилки. Дані були проаналізовані за допомогою статистичного програмного забезпечення SAS.

Отримані результати

Первинні цитокіни IL-1β і TNF-α швидко індукуються у відповідь на фізичний стрес, і помітні зміни в рівнях цих цитокінів були відзначені в гострій фазі загоєння після шліфування за допомогою CO2-лазера. Рівні мРНК IL-1β були підвищені (у 185 разів) через 1 день після лікування і різко зросли між 2 і 3 днями, коли рівні збільшилися до 694 разів від вихідного рівня. Рівні мРНК IL-1β залишалися сильно підвищеними протягом 6 днів після шліфування, досягаючи піку в 839-кратному збільшенні на 6 день, а потім швидко знижувалося між 6 і 8 днями. Підвищені рівні мРНК TNF-α спочатку спостерігалися протягом перших 3 днів після лікування і були максимальними (в 5,7 рази) на 6 день. Рівні мРНК TNF-α, як і рівні IL-1β, потім різко впали між 6 і 8 днями після лікування. Ці первинні цитокіни, як відомо, індукують ММП, і тому ми спробували вивчити рівні декількох ММП.