Ремоделирование соединительной ткани под действием углекислотного лазера для шлифовки фотоповрежденной кожи

Цель: количественно изучить динамику молекулярных изменений, вовлеченных в ремоделирование дермы после лазерной шлифовки фотоповрежденной кожи человека с помощью диоксида углерода (CO2). Дизайн: Последовательные биохимические анализы in vivo после лазерной терапии.

Субъекты: Добровольческая выборка из 28 взрослых в возрасте от 48 до 76 лет с клинически очевидными фотоповреждениями предплечий.

Вмешательство: Фокусная шлифовка CO2-лазером фотоповрежденных предплечий и серийные биопсии на исходном уровне и в разное время после лечения.

Основные показатели результатов. Для оценки уровней проколлагенов типа I и типа III использовались технологии полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскриптазой и иммуногистохимия; матриксные металлопротеиназы (ММП) 1, 3, 9 и 13; тропоэластин; фибриллин; первичные цитокины интерлейкин 1β и фактор некроза опухоли α; и профибротический цитокин, трансформирующий фактор роста β1.

Результаты. Продукция проколлагена типа I и матричная РНК проколлагена типа III достигла пика в 7,5 и 8,9 раз выше исходного уровня, соответственно, через 21 день после лечения и оставалась повышенной в течение как минимум 6 месяцев. Повышение уровня информационной РНК нескольких цитокинов (интерлейкина 1β, фактора некроза опухоли α и трансформирующего фактора роста β1) предшествовало и / или сопровождало изменения уровней коллагена. Было отмечено заметное увеличение уровней матричной РНК ММП-1 (39 130 раз), ММП-3 (1041 раз), ММП-9 (75 раз) и ММП-13 (767 раз). Уровни фибриллина и тропоэластина повышались с задержкой через несколько недель после лечения.

Выводы: Биохимические изменения, наблюдаемые после шлифовки с помощью CO2-лазера, происходят в результате хорошо организованной и хорошо воспроизводимой реакции заживления ран, что приводит к заметным изменениям в структуре дермы. Эти количественные изменения могут служить средством для сравнения, поскольку оцениваются другие терапевтические методы, предназначенные для улучшения внешнего вида фотоповрежденной кожи.

Лазерная шлифовка на углекислом газе (CO2) остается одним из наиболее эффективных методов омоложения лица. В то время как несколько механизмов могут быть задействованы в создании косметических улучшений, наблюдаемых после абляционной лазерной шлифовки, повышенная выработка коллагена, по-видимому, является одним из наиболее значимых. Несмотря на ряд гистологических и ультраструктурных исследований эффектов терапии CO2-лазером, относительно мало известно о результирующих количественных изменениях выработки коллагена и времени, в течение которого эти события происходят. Таким образом, мы стремились количественно изучить изменения в уровнях коллагена после обработки CO2-лазером фотоповрежденной кожи человека in vivo вместе с изменениями нескольких ключевых генов, которые, как известно, участвуют в ремоделировании дермы.

Мы предположили, что заживление после шлифовки с помощью CO2-лазера будет соответствовать фундаментальным механизмам заживления ран. Однако мы полагали, что результирующие количественные изменения в выработке коллагена могут быть значительно больше, чем наблюдаемые после ранения, связанные с другими причинами, таким образом, по крайней мере, частично объясняя значительные клинические улучшения, связанные с этим методом лечения. Несмотря на недавнее появление множества неабляционных лазеров и других устройств, направленных на улучшение морщин, связанных с фотостарением, абляционная лазерная шлифовка остается золотым стандартом в этой области с точки зрения эффективности. Таким образом, дополнительная цель этого проекта - предоставить количественную картину биохимических изменений, связанных с терапией лазером CO2, с которой можно в конечном итоге сравнить эффекты других новых неабляционных методов лечения. Хотя биохимические изменения не всегда приводят непосредственно к клиническим изменениям, такая сравнительная информация может в конечном итоге предоставить врачам и пациентам информацию, полезную для принятия терапевтических решений.

Методы и материалы

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Медицинской школы Мичиганского университета в Анн-Арборе, и от всех участников исследования было получено письменное информированное согласие. Было набрано 28 человек в возрасте от 48 до 76 лет с клинически очевидными фотоповреждениями предплечий. Каждому субъекту в фокальную область одного предплечья вводили 1% лидокаина с адреналином для достижения анестезии, а затем обрабатывали CO2-лазером в течение 2 проходов при 300 мДж и 60 Вт и с настройками компьютерного генератора шаблонов 3/5/6. Перфорированные биопсии (3 мм) получали из обработанной области на исходном уровне и до 5 дополнительных временных точек после лечения. Между каждым участком биопсии оставалось не менее 5 мм обработанной лазером кожи, не взятой для биопсии. В результате лечения полностью удален межфолликулярный эпидермис. Тотальную РНК экстрагировали из образцов кожи на всю толщину, а уровни матричной РНК (мРНК) конкретных генов количественно определяли с помощью технологии полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени. Образцы тканей анализировали на уровни матриксных металлопротеиназ (ММП) 1, 3 , 9 и 13; проколлаген типа I и типа III; интерлейкин 1β (ИЛ-1β); фактор некроза опухоли α (TNF-α); трансформирующий фактор роста β1 (TGF-β1); тропоэластин; и фибриллин. Определенные белки были локализованы иммуногистохимическим методом с использованием замороженных срезов. Срезы (7 мкм) окрашивали на MMP-1 моноклональным антителом MAB 1346, MMP-3 с моноклональным антителом MAB 13412, MMP-9 с моноклональным антителом MAB 13415 (все антитела MMP были получены от Chemicon International Inc, Темекула, Калифорния), и проколлаген I типа (SP1.D8, разработанный доктором медицины Хайнцем Фуртмайром и полученный из банка гибридных исследований развития, разработанный под эгидой Национального института детского здоровья и человеческого развития и поддерживаемый Департаментом биологических наук Университета Айовы). Наличие первичного антитела, связанного с тканью, визуализировали с помощью комплекса вторичное антитело-пероксидаза.

Образцы биопсии были получены от 4 субъектов в начале и через 6 месяцев после лечения. Эти субъекты участвовали в исследовании, которое включало ежедневное нанесение увлажняющего крема в течение 3 недель перед лечением лазером CO2. Все остальные аспекты исследования этих субъектов были аналогичны описанным ранее. Для биохимического анализа образцов кожи, полученных через 6 месяцев после обработки, и соответствующей предварительной обработки контрольная кожа, эпидермис и дерма были разделены с помощью лазерной микроскопии (Leica LMD Laser Microdissection System; Leica Microsystems Inc, Bannockburn, Ill). Уровни мРНК проколлагена и ММР в эпидермисе и дерме определяли количественно, как описано ранее.

Изменения в биохимических конечных точках в ходе исследования статистически оценивали с помощью дисперсионного анализа с повторными измерениями. Индивидуальные попарные сравнения значений в каждый последующий момент времени с исходными уровнями проводились с помощью теста Даннета. Частота ошибок типа I была установлена ​​на уровне 0,05. При необходимости перед анализом выполнялись логарифмические преобразования данных для достижения нормальности, и при необходимости данные отображались на фигурах с осями ординат с логарифмическим масштабированием. Сводная статистика включает средние и стандартные ошибки. Данные были проанализированы с помощью статистического программного обеспечения SAS.

Полученные результаты

Первичные цитокины IL-1β и TNF-α быстро индуцируются в ответ на физический стресс, и заметные изменения в уровнях этих цитокинов были отмечены в острой фазе заживления после шлифовки с помощью CO2-лазера. Уровни мРНК IL-1β были повышены (в 185 раз) через 1 день после лечения и резко возросли между 2 и 3 днями, когда уровни увеличились до 694 раз от исходного уровня. Уровни мРНК IL-1β оставались сильно повышенными в течение 6 дней после шлифовки, достигая пика в 839-кратном увеличении на 6 день, а затем быстро снижалось между 6 и 8 днями. Повышенные уровни мРНК TNF-α первоначально наблюдались в течение первых 3 дней после лечения и были максимальными (в 5,7 раза) на 6 день. Уровни мРНК TNF-α, как и уровни IL-1β, затем резко упали между 6 и 8 днями после лечения. Эти первичные цитокины, как известно, индуцируют ММП, и поэтому мы попытались изучить уровни нескольких ММП.

Наблюдалось заметное повышение уровней мРНК MMP-1, начавшееся в течение 3 дней после лечения (в 6335 раз) и достигающее максимума в 39–130 раз на 7 день. Затем уровни мРНК MMP-1 резко снизились в течение второй недели после лечения. Аналогичная временная картина наблюдалась в повышении уровней мРНК MMP-3, которые довольно быстро повышались между 2 и 7 днями после лазерной шлифовки, достигали пика в 1041 раз выше базового уровня через 7 дней после лечения, а затем резко снижались в течение следующей недели. Заметное повышение уровней мРНК MMP-9 также наблюдалось, начиная с 3 дней после шлифовки (в 27 раз) и достигая пика в 75 раз выше базового уровня через 6 дней после воздействия CO2-лазера. Хотя уровни мРНК MMP-9 достигли пика на 6-й день после лечения, в отличие от уровней MMP-1 и MMP-3, они оставались повышенными около пиковых уровней в течение по крайней мере 28 дней после шлифовки (в 42 раза). Интересно, что уровни мРНК MMP-13 повышались сравнительно медленно, начиная примерно через 1 неделю после лечения, но не повышались быстро до 10 дня. Уровни мРНК MMP-13 достигли пика в 767 раз больше базальных уровней на 14 день после обработки и впоследствии снизились в течение следующего 2-недельного периода, оставаясь несколько повышенными в 141 раз базовыми уровнями через 28 дней после шлифовки. Уровни мРНК MMP-1, MMP-3 и MMP-9 были оценены, и было обнаружено, что они снизились до исходных значений через 6 месяцев после лечения.

Уровни белка MMP-1, MMP-3 и MMP-9 также оценивали иммуногистохимически. Усиленное окрашивание белка на 7 день, совпадающее с описанными повышенными уровнями мРНК, было ясно видно для каждой из этих 3 ММР. Было отмечено, что окрашивание ММР-1 было внеклеточным и, в меньшей степени, внутриклеточным. Было обнаружено, что окрашивание ММР-3 в основном внеклеточное и в значительной степени связано с коллагеновыми волокнами, в то время как усиленное окрашивание ММР-9 было в основном внутриклеточным с гораздо меньшей степенью внеклеточного окрашивания. В то время как фибробласты производят ММР-1 и ММР-3 и, таким образом, определяют усиленное окрашивание этих ферментов, эти клетки не производят ММП-9. Мы полагаем, что воспалительные клетки, вероятно, нейтрофилы и / или макрофаги, ответственны за описанное выше окрашивание MMP-9. Матриксметаллопротеиназы связаны как с распадом, так и с ремоделированием коллагена, и затем мы исследовали уровни цитокина, TGF-β1, который, как известно, является сильно профибротическим, наряду с уровнями проколлагена типа I и типа III.

Уровни мРНК TGF-β1 резко повысились в течение 3 дней после лазерной шлифовки до 9,7-кратного исходного уровня на 2-й день после лечения и оставались повышенными примерно в 3,5–4 раза от исходного уровня в течение по крайней мере 28 дней после лечения. Хотя TGF-β является многофункциональным цитокином, одной из его основных ролей в коже является индукция биосинтеза проколлагена, как описано в следующем параграфе.

Одновременно со снижением уровней мРНК MMP-1 в течение второй недели после шлифовки, уровни мРНК проколлагена I и III типа довольно резко повысились, начиная с 10-го дня после лечения. К 14 дню уровни мРНК проколлагена I и III типа увеличились в 7,2 и 5,7 раз по сравнению с исходным уровнем соответственно. Уровни мРНК проколлагена типа I и типа III оставались повышенными и фактически продолжали несколько повышаться в течение следующей недели, достигнув пика в 7,5 и 8,9 раза соответственно на 21 день после лечения. Затем эти уровни начали снижаться между 21 и 28 днями после лечения. Изменения уровней проколлагенового белка I типа также были четко продемонстрированы иммуногистохимически. На исходном уровне слабое окрашивание проколлагеном I типа было в основном локализовано на дермо-эпидермальном соединении, а ниже этого у наших фотоповрежденных субъектов наблюдалось отсутствие положительного окрашивания. Однако через 21 день после лазерной шлифовки проколлаген I типа индуцировался в зоне восстановления между дермо-эпидермальным переходом и лежащей под ним полосой смещенного эластотического материала в глубоких слоях дермы. Через шесть месяцев после лечения сохранялось положительное окрашивание на проколлаген I типа, хотя интенсивность окрашивания была ниже, чем на 21 день. Образцы кожи, полученные через 6 месяцев после лазерной шлифовки, также были проанализированы с помощью лазерной микроскопии, так что вклад кожи в образование проколлагена оценивался отдельно. С помощью этого метода было обнаружено, что уровни мРНК проколлагена I типа в дерме были повышены в 12,8 раз от исходного уровня, а уровни мРНК проколлагена типа III были в 10,4 раза выше, чем при исходном уровне.

Хотя изменения в коллагене часто являются основным фокусом при рассмотрении эффектов шлифовки с помощью CO2-лазера, мы также стремились изучить изменения в эластичных тканях. Уровни мРНК тропоэластина постепенно повышались после лазерной шлифовки, начинающейся в течение второй недели после процедуры, и продолжали расти через 28 дней после лечения, когда эти уровни были в 2,4 раза выше, чем на исходном уровне. Уровни мРНК тропоэластина оставались повышенными в течение по крайней мере 6 месяцев у 3 из 4 субъектов. Аналогичным образом, уровни мРНК другого основного компонента эластиновых волокон, фибриллина, также постепенно увеличивались после шлифовки, увеличиваясь в 3,2 раза до базальных уровней через 28 дней после лечения. Кроме того, как уже отмечалось, было обнаружено, что дезорганизованный эластотический материал, обычно связанный с фотоповрежденной кожей, после лечения смещается глубже в дерму, и это было ясно видно иммуногистохимически.

Обсуждение исследования

Шлифовка поверхности с помощью углекислотного лазера явно эффективна для улучшения косметического состояния кожи пациентов. Однако относительно мало известно о деталях, касающихся задействованных молекулярных механизмов. Предполагаемые механизмы включают сокращение коллагена, физическое удаление фотоповрежденной ткани и неоколлагенез. Хотя клиническое омоложение кожи на самом деле может быть основано на сочетании этих факторов, мы стремились подробно изучить последний аспект лазерной шлифовки. Несколько исследований изучали образование нового коллагена после лазерной шлифовки с гистологической точки зрения, но, насколько нам известно, не было предварительного подробного количественного исследования изменений в коллагене и нескольких ключевых генах, участвующих в ремоделировании дермы после лечения CO2-лазером.

Большая часть представленных данных основана на технологии полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени, которая позволяет количественно определять уровни мРНК в тканях. Преимущества этой техники как минимум 2-х кратные. Во-первых, он позволяет получать действительно количественные данные. Во-вторых, это чрезвычайно чувствительный метод, который позволяет обнаруживать даже очень тонкие молекулярные изменения в очень маленьких образцах тканей. Хотя измерения проводились на уровне мРНК, предыдущая работа, касающаяся биохимии коллагена в коже человека, указывает на высокую степень корреляции между уровнями мРНК и уровнями ассоциированных белков при работе с ключевыми молекулами, измеренными в этом исследовании.

Биохимические изменения, отмеченные после шлифовки с помощью CO2-лазера, протекают через хорошо организованную и воспроизводимую реакцию заживления ран. Некоторые из самых ранних изменений включают повышение уровней как IL-1β, так и TNF-α. Эти провоспалительные цитокины участвуют в фундаментальных механизмах, связанных с процессом восстановления тканей, и каждый из них, как известно, индуцирует ММП. Таким образом, имеет смысл, что вскоре после повышения уровней IL-1β и TNF-α, уровни некоторых важных MMP значительно повышаются. В частности, мы наблюдаем значительное повышение до почти 40 000 раз базового уровня коллагеназы 1 (MMP-1), фермента, который катализирует первую стадию деградации коллагена. Здесь мы полагаем, что ММР-1 индуцируется лазерной процедурой для разложения фотоповрежденного коллагена пациентов. Аналогичная временная картина с пиковыми уровнями ферментов, происходящими через 1 неделю после шлифовки, наблюдается для стромелизина (ММР-3), фермента, который разрушает как частично разрушенный коллаген, так и другие матричные белки, такие как протеогликаны и эластин.

Для расщепления молекулы коллагена необходимы как минимум 2 типа ММП, как коллагеназа, так и желатиназа. Также обнаружено, что уровни желатиназы B (MMP-9) максимально повышаются примерно через 1 неделю после лечения. Однако, в отличие от MMP-1 и MMP-3, уровни которых довольно резко снижаются через 2 недели после лазерной шлифовки, уровни MMP-9 снижаются гораздо медленнее. Фактически, уровни MMP-9 оставались повышенными на уровне, близком к пиковому (в 42 раза выше, чем исходный уровень) через 28 дней после шлифовки. Действие желатиназы следует за действием коллагеназы в процессе расщепления молекулы коллагена, и сравнительно отсроченное снижение уровня ММП-9 хорошо согласуется с этой концепцией. Долгоживущее повышение MMP-9 предполагает остаточную деградацию MMP-1-генерируемых фрагментов коллагена с помощью MMP-9.

Мы предполагаем, что клиренс фрагментированного фотоповрежденного коллагена за счет увеличения уровня ММП способствует образованию и отложению нового коллагена. Количественно мы видим заметное повышение уровней проколлагена как I, так и III типа, достигающее пика между 2 и 3 неделями после шлифовки с помощью CO2-лазера после снижения уровней MMP-1 и MMP-3. Тот факт, что уровни MMP-1 падают непосредственно перед образованием основной массы нового коллагена, защищает этот новый коллаген от активности MMP и, таким образом, позволяет получить чистый прирост коллагена в дерме. Уровни проколлагена I и III типа остаются повышенными в течение как минимум 6 месяцев после лазерной терапии. Это согласуется с клиническими наблюдениями о том, что кожа пациентов продолжает улучшаться в течение многих месяцев после лазерной шлифовки.

Трансформирующий фактор роста β1 является сильно профибротическим, и повышенные уровни этого цитокина в обработанной лазером CO2 коже, достигающие пика через 2 дня после лечения, но оставаясь высокими в течение как минимум 28 дней после шлифовки, способствуют продолжающемуся образованию нового коллагена. Повышенные уровни TGF-β1, описанные здесь, контрастируют с теми, которые были отмечены Новаком и др. в предыдущем исследовании относительно уровней этого цитокина после лечения CO2-лазером в модели in vitro, в которой использовались келоидные и нормальные линии клеток дермальных фибробластов, наблюдалась тенденция к подавлению TGF-β как в нормальных, так и в келоидных линиях клеток, происходящих из фибробластов, после воздействия CO2-лазера. Неясно, связано ли это различие с тем, что в текущем исследовании конкретно изучалась фотоповрежденная кожа, а не нормальная и келоидная ткань, или, возможно, оно основано на присущих различиях между нашим дизайном исследования in vivo и характером предыдущей работы in vitro.

Было отмечено, что уровни коллагеназы 3 (MMP-13) повышались позже, чем уровни MMPs 1, 3 и 9, достигая пика через 2 недели после лечения CO2-лазером. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что MMP-13 участвует в ремоделировании коллагена, которое происходит на более поздних стадиях заживления ран, а не в начальной деградации коллагена. Наши данные подтверждают концепцию, что MMP-13 выполняет функцию ремоделирования вновь продуцируемого коллагена, а не разрушает старые, поврежденные светом молекулы коллагена. Чтобы прояснить этот момент, необходимы дальнейшие исследования роли MMP-13 в ремоделировании дермы.

Миофибробласты - это специализированные дифференцированные фибробласты, которые отличаются от дермальных фибробластов экспрессией α-гладкомышечного актина, повышенной способностью сокращать фибриллы коллагена и повышенной выработкой коллагена I типа. Миофибробласты обнаруживаются в заживающих ранах на всю толщину, например, из-за ожогов или хирургических разрезов, и связаны с контрактурой и рубцеванием раны. Мы не смогли обнаружить миофибробласты (α-актин-положительные фибробласты гладких мышц) в любое время после шлифовки. Таким образом, заживление после шлифовки СО2-лазером качественно отличается от заживления других типов ран. Это различие может быть связано со сравнительно поверхностным характером ран, вызванных лазером CO2. Поскольку миофибробласты связаны с рубцеванием, можно предположить, что недостаток этих клеток в обычно заживающих ранах, вызванных лазером CO2, может иметь косметическое преимущество.

Хотя мы сосредоточились в основном на коллагене при рассмотрении косметических улучшений, вызванных терапией CO2-лазером, мы также обнаружили сравнительно скромные, но явные изменения в уровнях тропоэластина и фибриллина 1, двух основных компонентов эластичных волокон. Уровни этих молекул все еще повышались через 28 дней после лечения, а уровни мРНК тропоэластина оставались повышенными через 6 месяцев после шлифовки у 3 из 4 субъектов. По крайней мере, некоторые клинические преимущества, наблюдаемые при шлифовке с помощью CO2-лазера, могут быть основаны на повышенном уровне эластина. Однако, поскольку увеличение эластина на уровне белка не наблюдалось при иммуногистохимическом окрашивании (данные не показаны), клиническое значение изменений в экспрессии гена тропоэластина после терапии лазером CO2 неясно. С другой стороны, перемещение дезорганизованного эластичного материала, который является признаком фотоповрежденной кожи, глубже в дерму после лазерной шлифовки может иметь клиническое преимущество. Подобное смещение эластичного материала было продемонстрировано в прошлом после дермабразии.

Следует отметить, что мы пытались имитировать клиническую практику с точки зрения наших настроек лазера и использования in vivo фотоповрежденной кожи в качестве источника образцов тканей. В нашем исследовании мы использовали предплечья в качестве места лечения из-за практических ограничений в количестве образцов биопсии, которые можно было получить с лица. Хотя могут существовать небольшие различия в реакции фотоповрежденной кожи предплечья и лица на шлифовку с помощью CO2-лазера, нет никаких доказательств того, что фундаментальные механизмы заживления ран должны различаться между этими участками. Тем не менее, мы не можем исключить возможность того, что молекулярные изменения, наблюдаемые после шлифовки кожи лица, могут как-то отличаться от изменений, продемонстрированных в этом исследовании.

Мы надеемся, что представленные количественные данные послужат «мерой», с которой можно будет сравнивать биохимические эффекты других лазеров, в том числе неабляционных лазеров. Такое сравнение может в конечном итоге способствовать разработке более эффективных устройств, направленных на омоложение кожи. Данные, представленные в этой статье, описывают конкретные изменения в ключевых ферментах и ​​цитокинах, которые связаны с образованием желаемого количества нового коллагена, вызванным шлифовкой поверхности с помощью CO2-лазера. Теперь задача состоит в том, чтобы создать устройство, которое производит биохимические изменения, приближающиеся к изменениям в СО2-лазерах, но с более благоприятным профилем безопасности.